Unsur-unsur yang menyusun protoplasma ataupun protein adalah C, H, O, N, P dan S. Disamping enam unsur ini, masih ada empat belas unsur lain yang dinilai esensial. Kadar unsur-unsur hara mineral dalam tanaman, dipengaruhi oleh banyak faktor sehingga presentase kandungan dalam tanaman berbeda-beda (Leiwakabessy I.F. 2003)
Nitrogen merupakan unsur utama (salah satu) bagi tanaman dalam bentuk dan . Untuk mengatasi kekurangan nitrogen, petani memupuk lading pertanian dengan pupuk N anorganik sehingga masalah baru sering timbul seperti rusaknya lingkungan akibat pencemaran dan masalah yang lain, sehingga penggunaan pupuk organik hayati banyak yang diproduksi
Bakteri-bkteri yang sering dipakai sebagai bahan campuran bio-organic fertilizer adalah bakteri atau mikrob yang mampu bersimbiosis dengan sel tanaman. Rhizobium sp adalah bakteri aerob yang berbentuk batang dengan ukuran 0.5-0.9 m, tidak membentuk spora dan tumbuh cepat. Rhizobium sp adalah bakteri penambat nitrogen yang hidup dalam tanah dan bersimbiosis dengan sel akar tanaman legume. Spesise ini dapat menambat nitrogen sebanyak 110 kg lahan pertanian per tahun ( Handayanto, 2007)
Selain Rhizobium sp, mikrob penambat nitrogen yang lain adalah Azospirillum sp. bakteri ini hidup bebas dan tidak bersimbiosis dengan akar tanaman, mampu memperbaiki pertumbuhan akar tanaman, dan mengembalikan kesuburan tanah (Hastuti, dan Gunarto 1992). Djauli et al (1996) menyatakan tanggap klon ubi jalar terhadap inokulasi Azospirillum sp sangat beragam dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan tumbuh dan jenis strain bakteri yang diinokulasikan. Azospirillum sp memiliki ciri seperti; temperatur minimum berkisar antara 36º C, yang utama adalah mampu menghasilkan hormon pertumbuhan tanaman (IAA, sitokinin, dan GA)
Phospor atau fosfor merupakan unsur esensial kedua setelah N yang berperan penting dalam proses pertumbuhan tanaman serta metabolism dalam proses pertumbuhan tanaman, dan proses mikrobiologi tanah. Fosfor dalam tanah 70% berada dalam keadaan tidak terlarut (Forth, 1990). Ketersediaan P dalam tanah ternyata sangat tergantung pada aktivitas mikroorganisme tanah (Amarisi dan Oslen, 1973) seperti adanya aktivitas dari kelompok mikroorganisme pelarut fosfat (Rao, 1982). Mikrob pelarut fosfat merupakan mikrob non patogen, dan termasuk golongan mikrob pemicu pertumbuhan tanaman. Mikrob ini terbagi menjadi bakteri dan fungi yang menghasilkan vitamin dan fitohormon yang dapat memperbaiki pertumbuhan akar tanaman dan meningkatkan serapan hara (Glick, 1995).
Metode Kjeldahl atau Kjeldahl digestion dalam analisi kimia berarti sebuah metode yang dipakai dalam melihat nilai kuantitaif determinasi dari nitrogen yang dikembangkan oleh Jhon Kjeldahl pada tahun 1883. Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung. Metode ini terdiri dari tiga cara yaitu; proses destruksi, destilasi dan titrasi. Dalam metode kjeldahl nitrogen dalam contoh diubah menjadi ammonium melalui proses digestion dengan asam sulfat pekat yang berisi bahan-bahan lain yang membantu perubahan tersebut. Amonium yang terbentuk didestilasi dengan menambahkan alkali dan NH3 yang terdestilasi ditangkap oleh asam dan ditentukan jumlahnya melalui titrasi. Bahan-bahan yang membantu perubahan N menjadi NH4+ adalah garam-garam biasanya K2SO4,NaSO4, atau H2SO4 yang bertujuan untuk meningkatkan suhu. Selain itu beberapa katalisator seperti selenium, air raksa, paraffin cair digunakan untuk merangsang dan mempercepat oksidasi bahan organik (Sutandi 2006).
Gas kromatografi dapat digunakan untuk menguji penambatan nitrogen. GC adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang mudah menguap dari aliran gas, tempat injeksi, kolom pemisah dan detektor.
Mikrob pelarut fosfat digunakan untuk mengetahui pelarutan P. Uji efektifitas pelarutan P menggunakan Bray untuk mengetahui jumlah P dan diukur dengan menggunakan spektofotometer untuk mengukur Media Pikovskaya cair mengandung 2, yang merupakan bentuk yang sukar larut. Inoklasi yang mengandung bakteri pelarut P akan berwarna keruh, sedangkan control akan tetap jernih. (Anonim, 2009).
Analisa Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.
3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna.
4. Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.
5. Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.
6. Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
Analisa Kuantitatif
Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.
Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut.
1. Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl, merupakan metode sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam pekat ( asam sulfat ), dan dikatalis dengan katalisator yang sesuai sehingga menghasilkan ammonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, ammonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak dimodifikasi, dan sangat cocok dipakai secara semimikro, sebab hanya membutuhkan jumlah sampel, dan pereaksi yang sedikit, dan waktu analisa yang pendek.
Metode Kjeldahl secara sistematik dibagi menjadi tiga tahapan, yaitu digestion (destruksi), dekomposisi nitrogen dalam sampel dengan bantuan larutan asam pekat. Hal ini sesuai dengan tanda, sampel homogen mendidih dalam asam sulfat pekat. Hasil akhirnya adalah, larutan ammonium sulfat. Untuk mempercepat reaksi atau proses destruksi ini, ditambahkan katalisator seperti selenium. Fungsi selenium adalah untuk menaikkan titik didih asam sulfat, sehingga destruksi berjalan dengan cepat. Yang kedua adalah tahap destilasi, dengan menambahkan basa berlebih pada campuran acid digestion untuk mengkonveksi NH4+ ke NH3, diikuti dengan mendidihkan dan mengkondensasi gas NH3 ke larutan penerima (asam borat dalam jumlah berlebih).Proses yang terakhir adalah titrasi, apabila penampung destilat menggunakan asam klorida, maka sisa asam klorida akan bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH dan ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi merah muda. Namun dalam praktikum ini, destilatnya menggunakan asam borat, sehingga dititrasi dengan Hcl, sehingga banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui. Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari hijau menjadi merah muda.
Mikrob yang menambat N2 hidup bebas, salah satunya adalah Azospirillum sp. Bakteri ini adalah mikrob yang bersifat mikroaerofilik, dan terdapat biasanya di daerah rhiziosfer, sebab bakteri tersebut memerlukan eksudat dari tanaman. Azospirillum berasal dari kata Azote yang berarti nitrogen ( Perancis) dan spirillum yang berarti spiral. Dengan demikian Azospirillum berarti spiral nitrogen kecil. Keuntungannya adalah mampu mengikat N2 bebas dari udara, dan menjadi tersedia bagi tanaman, melindungi tanaman dari patogen, menstimulir pertumbuhan tanaman melalui produksi auksin, hormone dan vitamin serta zat pengatur tumbuh.
Dari hasil praktikum, ditunjukkan bahwakadar N pada sampel satu sampai enam berturut-turut adalah , 0,0168 %, 5,6. %, 8,4. %, 8,4. %, -2,8. %, dan 2,8. %. Berdasarkan Sutanto (2002), penambatan N berkisar antara 12 sampai 36 mg dalam satu gram substrat.
Azospirillum sp membutuhkan kondisi lingkunagn mikroaerofilik dalam fiksasi nitrogen molecular tetapi dapat tumbuh cepat pada medium yang mengandung ammonium tanpa memfiksasi nitrogen. Berdasarkan hasil, terdapat kadar N sebesar -2,8. %, disebabkan olehketelitian praktikan yang kurang saat mentitrasi sehingga terjadi kesalahan dalam perhitungan.
Pada praktikum ini metode yang dipakai adalah metode Gas Chromatography, namun kendala yang dihadapi adalah penggunaan kromatografi gas tidak dilakukan karena kerusakan alat tersebut, sehingga metode Kjeldahl yang digunakan.
Penetapan Kadar
Prosedur :
1. Timbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl (kalau kandungan protein tinggi, misal kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g).
2. Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.
3. Panaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan teruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Tambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai dingin.
4. Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya tambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.
5. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih.
6. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.
7. Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.
Kadar Protein
Kadar protein dihitung dengan persamaan berikut :
Keterangan :
Fk : faktor koreksi
Fk N : 16
2. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.
3. Metode Lowry
Prosedur :
Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
Pembuatan reagen Lowry B :
Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%.
Penetapan Kadar
a. Pembuatan kurva baku
Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut :
Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)
b. Penyiapan Sampel
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.
4. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)
Prosedur :
Pembuatan reagen Biuret :
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda.
Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):
Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) :
Pembuatan kurva baku :
Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut:
Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada ë 550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800 µL reagen Biuret dan 200 µL aquades.
Cara mempersiapkan sampel :
Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva baku.
5. Metode Spektrofotometri UV
Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel.
Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x pengenceran
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2008. Protein. (http://www.wikipedia.com) diakses tanggal 12 Oktober 2008.
Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.
Page, D.S. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Erlangga: Jakarta.
Santoso, H. 2008. Protein dan Enzim. (http://www.heruswn.teachnology. com) diakses tanggal 12 Oktober 2008.
Sloane, E. 2004. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Penerbit Buku Kedokteran EGC: Jakarta.
Anonim. 2007. Manfaat Protein dalam Kehidupan Sehari-hari. (http://www.blogger.com) diakses tanggal 12 Oktober 2008
Sudjadi, A. dan Rohman. 2004. Analisis Obat dan Makanan cetakan I. Yogyakarta: Yayasan Farmasi Indonesia.
Apriyantono, A. dkk. 1989. Analisis Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit UI-Press.
Kamal, M. 1991. Nutrisi Ternak Dasar. Laboratorium Makanan Ternak, Yogyakarta: UGM-Press
http://mgmpkimiasumbar.wordpress.com/2009/02/11/reaksi-analisa-protein/
Amarisi, S. L. and S. R. Oslen, 1973. Liming As Related to Solubility of P and Plant Growth in acid tropical soil. Soil scientist society of America Proceeding 37: 716-721.
Dwijoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Imagraph.
Glick, B. R. 1995. The Enchanment Of Plant growth by free living bacteria. Canadian Journal Microbiology 41: 109-117.
Handayanto dkk. 2007. Biologi Tanah Landasan Pengelolaan Tanah Sehat. Pustaka Adipura.
Hastuti, R. D. and L. Gunarto. 1992. Pengaruh Inokulasi Azospirillum strain 202 dan 102 Terhadap Tanaman jagung. Balittan Bogor 2 : 443-449.
Leiwakabessy. I. F. 2003. Kesuburan Tanah. Jurusan Tanah IPB.
Rao, N. S. S. 1982. Phosphate Selobilization by soil microorganism. In N. S. Rao (ed). Advanced in Agricultural Microbiology. New Delhi : Oxford and IBH Publishing. co
0 komentar:
Posting Komentar