UJI ZAT PEWARNA METODE KROMATOGRAFI KERTAS

A.     Zat Pewarna Makanan

1.     Jenis pewarna

Ada dua jenis zat warna yang biasa digunakan dalam pengolahan pangan, yaitu pewarna alami dan sintetis. Semua zat pewarna alami dapat digunakan dalam pengolahan pangan, tetapi tidak begitu dengan pewarna sintetis. Pewarna sintetis yang biasa digunakan dalam pengolahan pangan biasa disebut dengan Food Colour.

a.      Pewarna Makanan Alami (Food Colour)

Pewarna alami merupakan pewarna yang berasal dari tumbuh-tumbuhan atau hewan yang lebih aman untuk dikonsumsi. Contohnya karotenoid adalah kelompok zat warna yang meliputi warna kuning, oranye, dan merah. Biasanya terdapat pada tomat, wortel, cabai merah, dan jeruk. Sedangkan dari hewan terdapat dalam lobster dan kulit udang.

b.       Pewarna Sintesis (Non Food Colour)

Pewarna buatan/sintetis adalah pewarna yang biasanya dibuat dipabrik-pabrik dan berasal dari suatu zat kimia. Pewarna ini digolongkan kepada zat berbahaya apabila dicampurkan ke dalam makanan. Pewarna sintetis dapat menyebabkan gangguan kesehatan terutama pada fungsi hati dalam tubuh kita. Contoh-contoh zat pewarna sintesis yang digunakan antara lain indigoten, allura red, fast green, tartrazine.

2.     Bahaya jika Digunakan pada Makanan

Proses pembuatan zat pewarna sintetik biasanya melalui perlakuan pemberian asam sulfat atau asam nitrat yang sering kali terkontaminasi oleh arsen atau logam berat lain yang bersifat racun. Pada pembuatan zat pewarna organik sebelum mencapai produk akhir, harus melalui suatu senyawa antara yang kadang-kadang berbahaya dan sering kali tertinggal dalam hasil akhir, atau terbentuk senyawa-senyawa baru yang berbahaya. Untuk zat pewarna yang dianggap aman, ditetapkan bahwa kandungan arsen tidak boleh lebih dari 0,00014 persen dan timbal tidak boleh lebih dari 0,001 persen, sedangkan logam berat lainnya tidak boleh ada.

Kelarutan pewarna sintetik ada dua macam yaitu dyes dan lakes. Dyes adalah zat warna yang larut air dan diperjualbelikan dalam bentuk granula, cairan, campuran warna dan pasta. Digunakan untuk mewarnai minuman berkarbonat, minuman ringan, roti, kue-kue produk susu, pembungkus sosis, dan lain-lain. Lakes adalah pigmen yang dibuat melalui pengendapan dari penyerapan dyes pada bahan dasar, biasa digunakan pada pelapisan tablet, campuran adonan kue, cake dan donat.

Rhodamin B

Rhodamin B adalah salah satu pewarna sintetik yang tidak boleh dipergunaan untuk makanan, selain itu pewarna lainnya yang dilarang adalah Metanil Yellow Rhodamin B memiliki rumus molekul C28H31N2O3Cl, dengan berat molekul sebesar 479.000. Rhodamin B berbentuk kristal hijau atau serbuk-unggu kemerah-merahan, sangat mudah larut dalam air yang akan menghasilkan warna merah kebiru-biruan dan berflourensi kuat. Selain mudah larut dalam air juga larut dalam alkohol, HCl dan NaOH. Rhodamin B ini biasanya dipakai dalam pewarnaan kertas, di dalam laboratorium digunakan sebagai pereaksi untuk identifikasi Pb, Bi, Co, Au, Mg, dan Th. Rhodamin B sampai sekarang masih banyak digunakan untuk mewarnai berbagai jenis makanan dan minuman (terutama untuk golongan ekonomi lemah), seperti kue-kue basah, saus, sirup, kerupuk dan tahu (khususnya Metanil Yellow), dan lain-lain.

Tanda-tanda dan gejala akut bila terpapar Rhodamin B:

1. Jika terhirup dapat menimbulkan iritasi pada saluran pernapasan.
2.   Jika terkena kulit dapat menimbulkan iritasi pada kulit.
3.   Jika terkena mata dapat menimbulkan iritasi pada mata, mata kemerahan, udem pada kelopak mata.

4. Jika tertelan dapat menimbulkan gejala keracunan dan air seni berwarna merah atau merah muda.

Metanil Yellow juga merupakan salah satu zat pewarna yang tidak diizinkan untuk ditambahkan ke dalam bahan makanan. Metanil Yellow digunakan sebagai pewarna untuk produk-produk tekstil (pakaian), cat kayu, dan cat lukis. Metanil juga biasa dijadikan indikator reaksi netralisasi asam basa.

Berikut adalah beberapa jenis pewarna sintetis/buatan yang populer dan efek samping yang ditimbulkan:

1. Tartrazine (E102 atau Yellow 5)

Tartrazine adalah pewarna kuning yang banyak digunakan dalam makanan dan obat-obatan. Selain berpotensi meningkatkan hiperaktivitas anak, pada sekitar 1 - 10 dari sepuluh ribu orang, tartrazine menimbulkan efek samping langsung seperti urtikaria (ruam kulit), rinitis (hidung meler), asma, purpura (kulit lebam) dan anafilaksis sistemik (shock). Intoleransi ini tampaknya lebih umum pada penderita asma atau orang yang sensitif terhadap aspirin.
2. Sunset Yellow (E110, Orange Yellow S atau Yellow 6)

Sunset Yellow adalah pewarna yang dapat ditemukan dalam makanan seperti jus jeruk, es krim, ikan kalengan, keju, jeli, minuman soda dan banyak obat-obatan. Untuk sekelompok kecil individu, konsumsi pewarna aditif ini dapat menimbulkan urtikaria, rinitis, alergi, hiperaktivitas, sakit perut, mual, dan muntah.

3. Ponceau 4R (E124 atau SX Purple)

Ponceau 4R adalah pewarna merah hati yang digunakan dalam berbagai produk, termasuk selai, kue, agar-agar dan minuman ringan. Selain berpotensi memicu hiperaktivitas pada anak, Ponceau 4R dianggap karsinogenik (penyebab kanker) di beberapa negara, termasuk Amerika Serikat, Norwegia, dan Finlandia.

4. Allura Red (E129)

Allura Red adalah pewarna sintetis merah jingga yang banyak digunakan pada permen dan minuman. Allura Red sudah dilarang di banyak negara lain, termasuk Belgia, Prancis, Jerman, Swedia, Austria dan Norwegia.

Sebuah studi menunjukkan bahwa reaksi hipersensitivitas terjadi pada 15% orang yang mengkonsumsi Allura Red. Dalam studi itu, 52 peserta yang telah menderita gatal-gatal atau ruam kulit selama empat minggu atau lebih diikutkan dalam program diet yang sama sekali tidak mengandung Allura Red dan makanan lain yang diketahui dapat menyebabkan ruam atau gatal-gatal. Setelah tiga minggu tidak ada gejala, para peserta kembali diberi makanan yang mengandung Allura Red dan dimonitor. Dari pengujian itu, 15% kembali menunjukkan gejala ruam atau gatal-gatal.

5. Quinoline Yellow (E104)

Pewarna makanan kuning ini digunakan dalam produk seperti es krim dan minuman energi. Zat ini sudah dilarang di banyak negara, termasuk Australia, Amerika, Jepang dan Norwegia karena dianggap meningkatkan risiko hiperaktivitas dan serangan asma.

Di Indonesia, regulasi mengenai pewarna yang diijinkan untuk ditambahkan pada makanan dan minuman diatur di dalam Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 33 tahun 2012 mengenai Bahan Tambahan Pangan (BTP). Peraturan ini ditetapkan pada 12 Juli 2012, menggantikan regulasi-regulasi tentang BTP sebelumnya (Permenkes No. 722/Menkes/Per/IX/88; Permenkes No. 1168/Menkes/Per/X/1999; Permenkes No. 208/Menkes/ IV/1985).

3.     Pewarna Yang Diijinkan Sebagai BTP

Ada 27 golongan bahan tambahan pangan (BTP) yang diatur dalam Permenkes No 033 tahun 2012. Salah satunya adalah pewarna. Bahan tambahan pangan (BTP), dalam Permenkes No. 033 tahun 2012 secara umum dijelaskan sebagai bahan yang ditambahkan ke dalam pangan untuk mempengaruhi sifat atau bentuk pangan. Sedangkan pewarna didefiniskan sebagai bahan tambahan pangan berupa pewarna alami dan pewarna sintetis, yang ketika ditambahkan atau diaplikasikan pada pangan, mampu memberi atau memperbaiki warna.

Sesuai Permenkes No. 003 tahun 2012, terdapat 15 jenis pewarna alami dan 11 jenis pewarna sintetis yang diijinkan untuk digunakan sebagai BTP. Berikut ini adalah nama-nama pewarna tersebut :

Pewarna Alami:
1. Kurkumin CI. No. 75300
2. Riboflavin :
- Riboflavin (sintetik)
- Riboflavin dari 5’-natrium fosfat
- Riboflavin dari Bacillus subtilis
3. Karmin dan ekstrak cochineal CI. No. 75470
4. Klorofil CI. No. 75810
5. Klorofil dan klorofilin tembaga kompleks CI. No. 75810
6. Karamel I
7. Karamel III amonia proses
8. Karamel IV amonia sulfit proses
9. Karbon tanaman CI. No. 77266
10. Beta-karoten (sayuran) CI. No. 75130
11. Ekstrak anato CI. No. 75120 (berbasis bixin)
12. Karotenoid :
- Beta-karoten (sintetik) CI. No. 40800
- Beta-karoten dari Blakeslea trispora
- Beta-apo-8’-karotenal CI. No. 40820
- Etil ester dari beta-apo-8’ asam karotenoat CI. No. 40825
13. Merah bit
14. Antosianin
15. Titanium dioksida CI. No. 77891

Pewarna Sintetis :
1. Tartrazin CI. No. 19140
2. Kuning kuinolin CI. No. 47005
3. Kuning FCF CI. No. 15985
4. Karmoisin CI. No. 14720
5. Ponceau 4R CI. No. 16255
6. Eritrosin CI. No. 45430
7. Merah allura CI. No. 16035
8. Indigotin CI. No. 73015
9. Biru Berlian FCF CI. No. 42090
10. Hijau FCF CI. No. 42053
11. Coklat HT CI. No. 20285

B.     Kromatografi Kertas

KROMATOGRAFI adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner (fase diam) dan yang lainnya berupa fase mobil (fase gerak). Fase gerak dialirkan menembus atau sepanjang fase stasioner. Fase diam cenderung menahan komponen campuran, sedangkan fase gerak cenderung menghanyutkannya. Berdasarkan terikatnya suatu komponen pada fase diam dan perbedaan kelarutannya dalam fase gerak, komponen-komponen suatu campuran dapat dipisahkan. komponen yang kurang larut dalam fase gerak atau yang lebih kuat terserap atau terabsorpsi pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap akan bergerak lebih cepat.

KROMATOGRAFI KERTAS biasa di pakai dalam menganalisa senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam simplisia ataupun bahan lainnya. Keuntungan utama kromatografi kertas ialah dari proses kemudahannya dan kesederhanaannya dalam pelaksanaan pemisahan yaitu hanya pada lembaran kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Selain itu keuntungan menggunakan kromatografi kertas ialah keterulangan bilangan Rf yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rf dapat menjadi parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru.

Hasil pemisahan dianalisis berdasarkan harga atau nilai faktor retardasi (Rf) pada masing-masing noda, bercak atau spot yang dihasilkan pada pelarut yang sama. Apabila diperoleh jarak noda yang sama dengan sampel standar, berarti sampel yang dianalisis sama dengan sampel standar. Perhitungan niali Rf dilakukan dengan cara membagi jarak yang ditempuh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh pelaru.

Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran. Untuk memperoleh materi murni dari suatu campuran, harus dilakukan pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran. Metode pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan distribusi molekul-molekul komponen di antara dua fase (fase gerak dan fase diam) yang kepolarannya berbeda. Apabila molekul-molekul komponen berinteraksi secara lemah dengan fase diam maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan fase diam. Keberhasilan pemisahan kromatografi bergantung pada daya interaksi komponen-komponen campuran dengan fase diam dan fase gerak. Apabila dua atau lebih komponen memiliki daya interaksi dengan fase diam atau fase gerak yang hampir sama maka komponen-komponen tersebut sulit dipisahka.

Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari botani Rusia yang menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang terdiri dari dua kata yaitu chromos yang berarti warna dan graphos yang berarti menulis. Meskipun kromatografi diturunkan dari kata warna dan tulis, warna senyawa-senyawa tersebut jelas hanya kebetulan saja terjadi dalam proses pemisahan ini. Tswett sendiri mengantisipasi penerapan pada beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera ditanggapi dan diperluas, beberapa bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi tetap tersembunyi sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotena tumbuhan dilaporkan oleh ahli sains organik terkemuka yaitu Kuhn. Penelitian ini menarik lebih banyak perhatian dan kromatografi adsorsi menjad meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil alam.

Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang digunakan. Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, maka berdasarkan fase bergerak-fase diam terdapat empat macam sistem kromatografi, yaitu: kromatografi gas-cair, kromatografi gas-padat, kromatografi cair-padat dan kromatografi cair-cair. Kromatografi juga dapat didasarkan atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi (Partition chromatography) dan kromatografi serapan (Adsorption chromatography). Sedangkan menurut teknik kerja yang digunakan, misalnya kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kertas dan kromatografi gas.

Selain cara klasifikasi di atas ada juga yang digabung, misalnya kromatografi partisi gas-cair, kromatografi partisi cair-cair, kromatografi adsorbsi cair-padat dan lain-lain. Juga dikenal kromatografi penukar ion dan kromatografi filtrasi gel yang prinsipnya berbeda dari prinsip kromatografi yang telah disebutkan sebelumnya. Pada tabel 1, dicantumkan jenis-jenis kromatografi yang umumnya dipakai.

Menurut Aswar (2010), prinsip kromatografi pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan sedemikian rupa dengan memanipulasi sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau molekul yaitu :

1.    Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan).

2.    Kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk bahan padat (absorbsi).

3.    Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas).

Teknik kromatografi kertas diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin (1944) yang menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam. Kertas merupakan selulosa murni yang mempunyai afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lainnya. Bila air diadsorpsikan pada kertas, maka akan membentuk lapisan tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom. Lembaran kertas berperan sebagai penyangga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap diantara struktur pori kertas. Cairan fase bergerak yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik dan air akan mengalir membawa noda cuplikan yang didepositkan pada kertas dengan kecepatan berbeda. Pemisahan terjadi berdasarkan partisi masing-masing komponen diantara fase diam dan fase bergeraknya.

Proses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, kertas diletakkan di dalam ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis. Terdapat tiga teknik pelaksanaan analisis. Descending adalah salah satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak menuruni kertas akibat gaya gravitasi. Pada teknik ascending; pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Sedangkan yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi-kondisi berikut harus diperhatikan untuk memperoleh nilai Rf yang reprodusibel. Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5 oC. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa pengerjaan yang parallel, Rf-nya tidak boleh berbeda lebih dari ± 0,02.

Faktor retardasi (Rf) merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada kromatogram dan pada kondisi tetap merupakan besaran karakteristik dan reproduksibel. Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang ditempuh pelarut (fase bergerak). Rf = jarak yang ditempuh komponen /  jarak yang ditempuh pelarut